DIAGNOSI DI LABORATORIO: ricerca di Legionella in campioni di provenienza umana

La polmonite da Legionella ha dei sintomi che sono spesso indistinguibili dalle polmoniti causate da altri microrganismi e, per questo motivo, la diagnosi di laboratorio della legionellosi deve essere considerata complemento indispensabile alle procedure diagnostiche cliniche. Gli accertamenti di laboratorio devono essere attuati possibilmente prima che i risultati possano essere influenzati dalla terapia e devono essere richiesti al fine di attuare una terapia antibiotica mirata, contenere così l‟uso di antibiotici non necessari, evitare effetti collaterali, l‟insorgenza di microrganismi antibiotico-resistenti, ed in ultimo, ma non meno importante, ridurre i tempi di degenza e le spese sanitarie del nostro paese.

Test diagnostici per la legionellosi dovrebbero essere idealmente eseguiti in tutti i seguenti casi di polmonite:
•    in pazienti con malattia severa che richieda il ricovero in un reparto di terapia intensiva;

•    in pazienti che riferiscano fattori di rischio (Tabella 1);

•    in pazienti che siano stati esposti a Legionella durante un‟epidemia;

•    in pazienti in cui nessun altra eziologia è probabile.

La sensibilità e specificità dei metodi diagnostici per L. pneumophila sierogruppo 1 sono abbastanza elevate mentre sono inferiori per gli altri sierogruppi di L. pneumophila o per altre specie di Legionella.

I metodi di diagnosi per l‟infezione da Legionella correntemente utilizzati sono i seguenti:
•    isolamento del batterio mediante coltura;

•    rilevazione di anticorpi su sieri nella fase acuta e convalescente della malattia;

•    rilevazione dell‟antigene urinario;

•    rilevazione del batterio nei tessuti o nei fluidi corporei mediante test di immunofluorescenza;

•    rilevazione del DNA batterico mediante PCR (metodo non ancora validato). Si suggerisce vivamente l‟esecuzione di questo test come rapida analisi nei casi di polmonite sopra elencati. I campioni che da questo test avranno esito positivo, saranno saggiati poi mediante coltura. Questa pratica, adottata già da alcuni paesi europei, e suggerita dall‟ECDC, ha consentito di isolare un maggior numero di ceppi dai pazienti dando la possibilità di risalire alla fonte di infezione.

Tuttavia, poiché nessun metodo di diagnosi di legionellosi è sensibile e specifico al 100% (come indicato nei paragrafi successivi), è ormai opinione condivisa a livello internazionale, che maggiore è il numero di metodi diagnostici utilizzati, più corretta sarà la diagnosi di legionellosi.

Infatti, la negatività di uno o di tutti i test diagnostici utilizzati e validati non esclude che ci si possa trovare di fronte ad un caso di legionellosi.

In Tabella 3 sono indicati i vari metodi con le relative percentuali di sensibilità e specificità.

*La sensibilità della rilevazione dellì’antigene urinario effettuata mediante test immunocromatografico può decrescere da questo valore fino ad arrivare al 32% in alcuni kit disponibili in commercio, pertanto questo tipo di test dovrebbe essere utilizzato in aggiunta ad altri metodi per la diagnosi di legionellosi.

Metodo colturale

L‟isolamento mediante coltura è considerato il metodo diagnostico di elezione per la diagnosi di legionellosi. I campioni dovrebbero essere prelevati prima del trattamento antibiotico, sebbene Legionella sia stata isolata da secrezioni del tratto respiratorio e dal sangue anche dopo alcuni giorni di trattamento antibiotico.

I campioni del tratto respiratorio (BAL, tracheoaspirato, liquido pleurico) e il parenchima polmonare, dovrebbero essere tempestivamente coltivati (Allegato 2) (Stout et al., 2003).

Inoltre, un‟emocoltura negativa, seminata successivamente su terreno specifico per Legionella, può dar luogo all‟isolamento del microrganismo.

In alcuni casi Legionella è stata trovata in campioni provenienti da siti extra polmonari, specialmente in campioni autoptici (e.g., fegato, milza, fluido pericardico, reni, ascessi cutanei).

L‟isolamento del batterio richiede terreni di coltura specifici poiché Legionella non cresce sui terreni di uso comune (Allegato 2), ed ha tempi di crescita relativamente lunghi (4-10 giorni).

L‟analisi dei campioni clinici mediante coltura è estremamente importante, perché è il criterio diagnostico più specifico, permette l‟isolamento di tutte le specie e sierogruppi e consente lo studio comparativo con ceppi di Legionella isolati dall‟ambiente, presumibilmente associati all‟infezione, al fine di individuare la fonte dell‟infezione stessa.

L‟uso di colorazioni batteriologiche può essere solo parzialmente utile. Tuttavia, è necessario prendere in considerazione una diagnosi di legionellosi se si osservano batteri Gram-negativi nelle secrezioni delle basse vie respiratorie di un paziente immunocompromesso, con una coltura negativa dopo 24 ore sui terreni di uso corrente.

La coltura è particolarmente importante per la diagnosi in alcuni casi:
•    pazienti in cui la polmonite è severa e causa insufficienza respiratoria;

•    pazienti immunocompromessi;

•    infezioni nosocomiali;

•    casi in cui si sospetta che la causa sia  Legionella appartenente a specie differenti da

L. pneumophila sierogruppo 1.

Rilevazione dell’antigene urinario

La presenza dell‟antigene solubile di Legionella nelle urine (antigenuria) si rileva nella maggior parte dei pazienti da uno a tre giorni dopo l‟insorgenza dei sintomi, con un picco a 5-10 giorni; può persistere per alcune settimane o mesi, soprattutto in pazienti immunocompromessi, dove può persistere per quasi un anno (Kohler et al., 1984). Inoltre, essendo la sensibilità al test spesso associata alla gravità della malattia (Yzerman et al., 2002) per evitare una mancata diagnosi, nei casi di polmonite meno grave, si dovrebbe fare ricorso ad altri test diagnostici. La sua presenza, tuttavia, può essere a volte intermittente, ma si rileva anche in corso di terapia antibiotica (Luck et al., 2002). Questo test è attualmente validato esclusivamente per L. pneumophila sierogruppo 1, anche se, in una certa percentuale di casi, è stata riscontrata positività a seguito di infezioni causate da altri sierogruppi di Legionella (Benson et al., 2000; Olsen et al., 2009).

Pertanto la positività del test non implica necessariamente che l‟agente eziologico sia L. pneumophila sierogruppo 1, anche se questa è la situazione più frequente. La conferma può essere ottenuta solo con l‟utilizzo di altri metodi diagnostici (coltura, sierologia).

La determinazione può essere effettuata attraverso due metodi: metodo immunoenzimatico (EIA) e metodo immunocromatografico (ICT). Il trattamento del campione prima dell‟analisi è indicato nell‟Allegato 2.

Il metodo immunoenzimatico

L‟EIA ha una specificità dell‟80–85%, simile a quella della coltura (Svarrer CW et al., 2012; Helbig J et al 2003; Hackman et al., 1996; Kazandjian et al., 1997), ma una sensibilità maggiore. La determinazione dell‟antigene urinario mediante EIA è il metodo di scelta per la diagnosi di infezione da L. pneumophila sierogrouppo 1 (Svarrer CWet al., 2012;Cosentini et al., 2001; Formica et al., 2001;).
Il metodo immunocromatografico

E‟ un saggio molto rapido (15 min-1h) per la rilevazione dell‟antigene di L. pneumophila sierogruppo 1 che non richiede particolari attrezzature di laboratorio.

L‟interpretazione dei risultati si basa sulla presenza o meno di due bande colorate, una del campione e l‟altra del controllo. Qualsiasi linea visibile dà un risultato positivo. Tuttavia, campioni con bassa concentrazione di antigene potrebbero dare una linea di campione debole che può essere considerata “positiva” con sicurezza se aumenta in intensità, dopo 45‟ dalla prima osservazione (questo controllo è possibile solo con il test oggetto della pubblicazione di Helbig et al., 2001). Se la banda debole non aumenta di intensità, soprattutto nei casi in cui le urine sono patologiche in partenza (infezioni urinarie, proteinuria, ecc.) il referto deve essere formulato come dubbio, in attesa di essere confermato da altri test (Helbig et al., 2001).

Confrontato con altri metodi diagnostici, il test dell‟antigene urinario presenta evidenti vantaggi: i campioni sono ottenuti facilmente, è rilevabile nelle fasi precoci della malattia e il test è facile e rapido da effettuare, oltre che specifico. Inoltre può essere rilevato anche nella Febbre di Pontiac (Burnsed et al., 2007).

Uno svantaggio consiste nel fatto che, proprio per la sua persistenza, può risultare difficile distinguere tra infezione acuta, fase di convalescenza o infezione pregressa.

In casi sospetti, in presenza di segni clinici di polmonite, oltre al test dell‟antigene urinario andrebbe effettuato un ulteriore test diagnostico (esame colturale, sierologico e PCR), anche se, come dimostrato da recenti studi (Svarrer et al., 2012), questa pratica dovrebbe essere sempre adottata a causa della non elevata sensibilità soprattutto del test immunocromatografico. Un altro limite del test è che rileva prevalentemente gli antigeni di L. pneumophila sierogruppo 1.

Inoltre, benché la sensibilità complessiva del test sia pari al 75-99% per infezioni dovute a tale microrganismo, è da rilevare che la sensibilità può variare in particolari sottopopolazioni: pazienti con legionellosi associata ai viaggi, legionellosi acquisita in comunità e nosocomiale. Infatti, in queste tre categorie la sensibilità è rispettivamente pari al 94%, 76-87% e 44-46% (Helbig et al., 2003). Queste differenze sono dovute al fatto che il test rileva principalmente alcuni ceppi di L. pneumophila che sono predominanti nei casi di legionellosi associata ai viaggi.

Falsi positivi sono stati descritti in pazienti con malattia da siero (Deforges et al., 1999) e in infezioni ascrivibili a Nocardia asteroides (Bailleul et al., 2004) ed in un episodio pseudoepidemico correlato ad alcuni lotti di un test immunocromatografico fallaci (Rota et al. 2014). Uno studio sistematico che ha saggiato il test con numerosi ceppi di Legionella ha rilevato una totale assenza di reattività di antigeni di specie di Legionella non-pneumophila (Okada et al., 2002).

Per rendere più affidabile la diagnosi mediante rilevazione dell‟antigene urinario è consigliabile bollire le urine (vedi paragrafo dedicato nell‟Allegato 2). La concentrazione delle urine migliora la sensibilità del test anche se può interferire con la specificità (Svarrer CW et al 2012).

Metodi sierologici

Immunofluorescenza indiretta (IFI)

I metodi sierologici sono utili per indagini epidemiologiche retrospettive ma sono meno validi per quelle cliniche, data la comparsa talvolta tardiva degli anticorpi specifici a livelli significativi e a causa della necessità di controllare un ulteriore campione di siero in fase di convalescenza.

Un aumento significativo del titolo anticorpale si presenta da 1 a 9 settimane dopo l‟insorgenza della malattia in circa i tre quarti dei pazienti con coltura positiva per L. pneumophila sierogrouppo 1. In media i pazienti sviluppano anticorpi in due settimane, tuttavia oltre il 25% delle sieroconversioni non viene rilevato perché i sieri non vengono correttamente prelevati nella fase precoce e convalescente della malattia. Inoltre la determinazione della classe anticorpale non è d‟aiuto nel differenziare tra un‟infezione in atto e un‟infezione pregressa. In alcuni studi le IgM si riscontano precocemente, altri studi hanno dimostrato che in questa fase ci sono sia IgM che IgG. In alcuni pazienti inoltre sono state riscontrate solo le IgG o solo le IgM, oppure possono persistere a lungo le IgM. Le IgA possono essere presenti in infezioni recenti ma vanno incontro a degradazione. Per questo motivo è opportuno utilizzare un test che metta in evidenza tutte le classi anticorpali.

Un aumento di quattro volte o più del titolo anticorpale tra due sieri prelevati nella fase acuta e convalescente della malattia ha valore diagnostico.

Un risultato positivo su un singolo siero (≥256) ha un valore diagnostico presuntivo.

La definizione di questi criteri aiuta ad evitare falsi positivi dovuti a reazioni crociate con altri patogeni. In generale, il metodo sierologico ha un valore predittivo positivo (proporzione di realmente malati tra i positivi al test) piuttosto basso. Inoltre si possono avere falsi negativi a causa della scarsa risposta anticorpale di pazienti con polmonite da Legionella che generalmente hanno difese immunitarie compromesse oppure a causa della sieroconversione a volte molto tardiva, oppure semplicemente a causa dell‟età avanzata in cui si verifica un naturale declino della risposta immunitaria. La sieroconversione può anche non essere osservata se nel test si utilizza un antigene non omologo (esistono ad esempio diversi sottotipi di L. pneumophila) che non reagisce con gli anticorpi sviluppati dal contatto con un altro sottotipo che può aver causato l‟infezione.

Si deve infine rilevare che la specificità e la sensibilità dell‟immunofluorescenza indiretta è stata valutata solo per L. pneumophila sierogruppo 1; la sensibilità e la specificità per altri sierogruppi o specie non sono note (Luck et al., 2002; Muder, 2000).

A causa della formazione di anticorpi cross-reattivi, circa il 50% dei pazienti infettati con L. pneumophila non-sierogrouppo 1 manifesta una sieroconversione con antigeni specifici di L. pneumophila sierogrouppo 1 (Edelstein, 2002). Un risultato negativo non esclude la diagnosi di legionellosi. Inoltre le preparazioni antigeniche differiscono nei diversi laboratori e tra le ditte produttrici di kit, e ciò produce diversi livelli anticorpali critici, pertanto per alcune preparazioni antigeniche la specificità potrebbe essere relativamente alta per un certo campione e bassa per un altro (Rose et al, 2002). L‟esistenza di reattività crociata tra Legionelle e altri microrganismi come ad esempio Campylobacter e Pseudomonas species (Boswell, 1996; Marshall et al., 1994), e la difficoltà di distinguere tra infezione in atto o infezione pregressa in caso di campione singolo di siero o di titolo anticorpale costante, rende la conferma diagnostica più complessa .

Microagglutinazione ed ELISA

Sono test sierologici più specifici per L. pneumophila sierogruppo 1 (Edelstein, 2002).

La microagglutinazione è un metodo rapido ed economico che permette di evidenziare anticorpi appartenenti essenzialmente, alla classe IgM, per questo motivo, e per tutto quanto detto in merito alla risposta anticorpale è una tecnica scarsamente utilizzata nella diagnosi di legionellosi.

Il metodo ELISA viene utilizzato sempre più frequentemente nei laboratori di diagnostica, grazie alla diffusione di numerosi kit commerciali; la concordanza tra il test ELISA e l‟immunofluorescenza è del 91% circa (Edelstein, 2002). La sensibilità è tra l‟80% e il 90% e la specificità è di circa il 98%.
 

Immunofluorescenza diretta (DFA)

L‟evidenziazione di Legionella nei campioni clinici per mezzo dell‟immunofluorescenza diretta, pur permettendo di confermare la diagnosi di polmonite da Legionella entro poche ore, ha una validità inferiore al metodo colturale. La tecnica si esegue in 2-3 ore circa, richiede una certa preparazione ed esperienza nella lettura del preparato ed è influenzata dalla specificità degli antisieri utilizzati e dalle dimensioni del preparato esaminato (Allegato 2). La DFA effettuata su escreato può dare risultati positivi fino a 2–4 giorni dopo l‟inizio della terapia antibiotica e spesso anche per periodi più lunghi in casi di polmonite cavitaria (Luck et al., 2002).

La DFA è un metodo efficace con campioni di espettorato, aspirati endotracheali e trans-tracheali e su biopsie polmonari (Stout et al., 2003). Pazienti con legionellosi diagnosticata mediante coltura hanno una DFA positiva tra il 25% e il 70%, tuttavia la specificità del test è superiore al 99,9%. Pertanto un risultato negativo non esclude la diagnosi di legionellosi, ma un risultato positivo ha quasi sempre un valore diagnostico se la lettura del vetrino è stata fatta in modo corretto. Molta attenzione deve essere posta per prevenire i falsi positivi in DFA, quando i campioni sono stati a contatto con acqua o tamponi contaminati.

L‟uso della coltura o dell‟immunofluorescenza diretta è diminuito e la maggior parte dei casi di legionellosi è attualmente diagnosticata mediante rilevazione dell‟antigene urinario. Come conseguenza di questo cambiamento la rilevazione di Lp1 è aumentata, ma tutti gli altri sierogruppi o specie sono sotto-diagnosticati.

Amplificazione di geni specifici mediante PCR

La diagnosi di legionellosi in campioni clinici mediante Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi o PCR) si basa sulla determinazione della presenza di DNA genomico di Legionella, attraverso amplificazione di geni specifici (Cloud et al., 2000; Murdoch, 2003). L‟introduzione della Real-Time PCR ha invece, rispetto alla PCR classica, il vantaggio di visualizzare la reazione in tempo reale, dando eventualmente anche informazioni sulla quantità di DNA presente nel campione. Per questo è molto spesso denominata anche PCR quantitativa (q-PCR). La Real-Time PCR è stata applicata per la singola determinazione di infezione da L. pneumophila e/o Legionella species (Templeton et al., 2003). Più recentemente inoltre sono stati pubblicati numerosi articoli in cui sono descritti protocolli di “multiplex real-time PCR” per la diagnosi di polmoniti causate da Legionella, in cui si evidenziano contemporaneamente Legionella pneumophila sierogruppo 1, tutti i sierogruppi di Legionella pneumophila e le altre specie di Legionella (Benitez AJ, Winchell JM, 2013). Attraverso la multiplex real-time PCR sono stati sviluppati anche dei saggi attraverso i quali è possibile mettere in evidenzia simultaneamente il DNA di Legionella e di alcuni dei microorganismi più frequentemente associati con le infezioni polmonari quali Chlamydia, Mycoplasma, Streptococcus (Nomanpour et al 2012; Al-Marzooq et al 2011, McDonough et al., 2005).

Gli articoli pubblicati illustrano come la diagnosi mediante amplificazione di geni specifici sia vantaggiosa rispetto all‟esame colturale perché richiede tempi di analisi di poche ore, ed ha una sensibilità pari, se non superiore, all‟esame colturale, pur utilizzando quantità minime di DNA genomico. La sensibilità della PCR dipende dal tipo di campione: è più elevata (> 99%) per analisi effettuate su campioni del tratto respiratorio (espettorato, broncoaspirato, broncolavaggio) e si riduce per campioni rappresentati da altri liquidi corporei (sieri o urine) (Murdoch 2003; Aoki et al., 2003; Diederen et al., 2007). La specificità è data dal gene e/o dalla porzione di gene target scelto per l‟amplificazione. I geni target più frequentemente analizzati sono: mip, 16S rDNA, 5S rDNA.

I saggi di Real-Time PCR per la rilevazione di Legionella su campioni clinici hanno il vantaggio rispetto alla PCR qualitativa di ridurre il rischio di contaminazione del campione, minimizzare il tempo di analisi ed essere ancora più specifici. Inoltre, rispetto ai metodi classici di identificazione, la Real-Time PCR permette il riconoscimento delle numerose specie ad oggi identificate e di tutti i sierogruppi della specie pneumophila.